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一個實驗設計的問題

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發表於 2007-7-22 13:41:27 | 顯示全部樓層 |閱讀模式
蛋白通過Immunohistochemistry檢測後得知在腫瘤細胞的細胞漿和細胞核中表達
再經由統計學分析得知該蛋白在細胞漿中的表達量與腫瘤的 invasion 和 metastasis 有正相關性
所以提出一個 hypothesis: 該蛋白表達越多時,越易發生癌細胞的侵潤和轉移
但礙於無實驗證據證明該假說是成立的
那麼下一步該用什麼 "實驗方法" 來證明細胞漿中的蛋白確實有促進癌細胞侵潤和轉移的能力,而非細胞核中的蛋白有促進癌細胞侵潤和轉移的能力

[ 本文最後由 jjj 於 2007-7-22 15:11 編輯 ]

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layin1 + 20 感謝分享!!!!

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發表於 2007-7-22 14:15:52 | 顯示全部樓層
原文由 jjj 於 2007-7-22 14:41 發表
我的蛋白通過Immunohistochemistry(免疫組化)的檢測方法得知在腫瘤細胞的細胞漿和細胞核中表達
再經由統計學分析得知該蛋白在細胞漿中的表達量與腫瘤的 invasion 和 metastasis 有正相關性
所以提出一個 hy ...


因為我也是學生命科學的,
所以看到有關生命科學的問題,就忍不住插話了。

我想到的方向是下面這樣:
1. 想辦法使腫瘤細胞大量表達你的蛋白,再去觀察發生癌細胞的侵潤和轉移的情形。
    預期結果:發生癌細胞的侵潤和轉移。
2. 想辦法使腫瘤細胞大量表達位於細胞漿中的你的蛋白,再去觀察發生癌細胞的侵潤和轉移的情形。
    預期結果:發生癌細胞的侵潤和轉移。
3. 想辦法使腫瘤細胞大量表達位於細胞核中的你的蛋白,再去觀察發生癌細胞的侵潤和轉移的情形。
    預期結果:沒有發生癌細胞的侵潤和轉移。

由此證實只有在你的蛋白大量表達在細胞漿時,才使發生癌細胞侵潤和轉移。

不過,事實上我是學微生物的,對腫瘤細胞基本上是一竅不通。
不知道我隨口說的想法是否可行,
更不要提”實驗方法”囉…
如果上面這個回答很可笑或是很外行的話,
請多多見諒。
不過大家多討論,相信會想出好辦法。

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參與人數 4現金 +30 收起 理由
xbio + 5 好阿∼
layin1 + 10 感謝分享
wang.hurh + 5 說的好!
tiongti + 10 超筆記ing........

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發表於 2007-7-22 17:42:25 | 顯示全部樓層
原文由 jjj 於 2007-7-22 14:41 發表
蛋白通過Immunohistochemistry檢測後得知在腫瘤細胞的細胞漿和細胞核中表達
再經由統計學分析得知該蛋白在細胞漿中的表達量與腫瘤的 invasion 和 metastasis 有正相關性
所以提出一個 hypothesis: 該蛋白表達 ...


先問個問題,

在IHC 後,是否有用過以 Western Blots 來說明『量』上的問題?(如果antibody 可用於 Western Blots) or 就是直接用 IHC signal 的高低來說明?

因為,既使看到 signals 較 controls 為高,要直接用IHC or IF signal 的 intensities 來做定量,遇到 reviewer 質疑的可能性,會是很高的

另外,如果建議用 Western 來定量,如果samples 允許的話,想辦法分離cytoplasm and nucleus 的蛋白,再做 Western Assay, 可以獲得進一步的證據,"強烈推測" 與你們所想的有直接相關性

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elco823 + 1 喔…學到了…^^
layin1 + 10 感謝分享
tiongti + 10 抄筆記ing.....順便幫你補一下..XD

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發表於 2007-7-23 21:58:45 | 顯示全部樓層
基本邏輯上的推論與建議,是很精準的!

其實,從實務的角度來看,

就看想要送入的  construct(s) 要如何設計了!

例如說,trucate 掉 NLS ,試試看是否可以造成無法 translocate 入 nuclei 中,但是又有 activity 的 product

再者,利用『非』highly expressed 的 promotor 來做 constructs, 找到那個決定性表現量的所在

拙見供參考!

[ 本文最後由 wang.hurh 於 2007-7-23 22:59 編輯 ]

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elco823 + 1 好有趣^^
layin1 + 10 這個我也不太懂,能再說清楚一些嗎??
primay + 30 太難懂了!加分!

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發表於 2007-7-23 22:55:00 | 顯示全部樓層
SORRY about it, but quiet disappoint this website

[ 本文最後由 layin1 於 2007-12-13 21:52 編輯 ]

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elco823 + 1 我很贊同,太冒險的實驗常是不成功的…
primay + 30 聽不懂!加分!
wang.hurh + 10 我也來加分!

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 樓主| 發表於 2007-7-24 15:30:18 | 顯示全部樓層
原文由 wang.hurh 於 2007-7-23 22:58 發表
基本邏輯上的推論與建議,是很精準的!

其實,從實務的角度來看,

就看想要送入的  construct(s) 要如何設計了!

例如說,trucate 掉 NLS ,試試看是否可以造成無法 translocate 入 nuclei 中,但是又 ...



是指cloningtransfection??

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wang.hurh + 1 基本上,是的!

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 樓主| 發表於 2007-7-24 15:31:57 | 顯示全部樓層
謝謝大家~~
目前尚未做蛋白定量這一步
所以接下來可以先分別提取細胞核蛋白和細胞漿蛋白,進行Western blot,再以其與癌細胞浸潤和轉移的marker做統計學的相關性分析??
或是直接做如 layin1所說的In vitro 的實驗??
但是如何Western Blots 來說明『量』上的問題
發表於 2007-7-25 16:57:59 | 顯示全部樓層
趁空檔,來認真的想一下這個問題:

首先,我不知道這邊所提的蛋白質是哪一種?

但是,研究者自己本身應該知道是哪一個,然後,

這種蛋白的特性為何?應該多少也知道;既使不完全知道,也會有方向所尋

先者,如果會被 translocate 到 nuclei, 在 nuclei 中,如有 function, 是哪方面的 function? 應該可以猜測一下(經由一些 in vitro data, i.e. could bind with which kind of domain(s)? ; functio for modification? directly or indirectly for transcriptional control...)

以 layin1 and elco823 的方向與邏輯上的建議:

Either overexpression(with proper construct into proper cells) or knowdown experiments(with proper cell lines), 應該可以看出的端倪

只是,目標長遠,如何一步一步的接近問題核心?
不同 background 的人(pure biochemist, cell biologist, clinical researcher, or others...),會有不同的建議!

主要的、實際的,端看所處的環境為何?指導者的建議、支持度為何?都會左右到自己能夠發揮到哪裡!?

layin1 第二段的建議,是比較容易著手的,也會得到較清楚的方向

因為,找出問題、提出假設後,以 data even use paper 要說服大家時,我想,很多讀者是飢渴的啊!

既使找出相關性、證明表達量有影響,如何找到交互作用點、進而有作用機制可以證明?那就會是一個完整、漂亮的故事啊

一步一步來,多閱讀些 papers,看看別人是如何接近、發掘、甚至是解決問題,在實際的做實驗層面,解決問題的層面,都會有慢慢累積,提昇自己實力的助益的!

加油!

[ 本文最後由 wang.hurh 於 2007-7-25 18:01 編輯 ]

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layin1 + 20 精品文章!!

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發表於 2007-7-25 21:32:24 | 顯示全部樓層
想請問一下jjj你的學習背景是那一方面的?
還有你們的實驗室是那一方面的??
因為Western blotting是生物實驗室最基本的技術
我想 如果你們的實驗室沒有我們上述的器具
那你們可能得想其他的方法來證明你的假設


原文由 jjj 於 2007-7-24 16:31 發表
謝謝大家~~
目前尚未做蛋白定量這一步
所以接下來可以先分別提取細胞核蛋白和細胞漿蛋白,進行Western blot,再以其”量”與癌細胞浸潤和轉移的marker做統計學的相關性分 ...

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wang.hurh + 1 一刀切入問題核心!

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 樓主| 發表於 2007-7-27 08:04:00 | 顯示全部樓層
我們的實驗室是分生實驗室,以上提到的方法中所需的道具我們實驗室都有
我想我會先分別提取細胞漿和細胞核蛋白,用免疫沈澱+Western blot進行初步的驗證,看結果再考慮是否繼續進行其他實驗
若可行,加做 cloning (upregulate and downregulate) transfection 後,將細胞進行 IHC 以定位蛋白的表達部位,同時提取細胞漿和細胞核蛋白進行免疫沈澱+Western blot的蛋白定量
發表於 2007-7-27 09:45:31 | 顯示全部樓層
原文由 <i>jjj</i> 於 2007-7-27 09:04 發表
我們的實驗室是分生實驗室,以上提到的方法中所需的道具我們實驗室都有
我想我會先分別提取細胞漿和細胞核蛋白,用免疫沈澱+Western blot進行初步的驗證,看結果再考慮是否繼續進行其他實驗
若可行,卉loning ...



拿到 proteins 之後,直接做 Western Blots,不要,也不用作 IP(因為做IP 之後,要以 IP 的結果說明『量』,會被人家質疑的!)

Good Luck!

[ 本文最後由 wang.hurh 於 2007-7-27 22:26 編輯 ]

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jjj + 2 + 1 感謝分享
layin1 + 20 我很贊同
xbio + 2 好阿∼分生太久沒玩..只剩光學物化..

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